增修三版說明
增修三版保留第一版大部分的架構,內容則參考新的文獻和資料重新寫過。讀者一定會問的一個問題是:從第一版到這一版,DNA 科學有沒有重大的變化?
第一版發行的 2005 年,人類基因體序列的解碼工程剛剛完成不久,大家對這樁科學成就充滿了期待和夢想。這些年來,科學界很多心力放在解讀生、老、病、死跟 DNA 序列之間的關係。這是一件非常龐雜的工程,經過多年的努力,幾乎人體的生理與病理,大多已可以找到基因的解釋。
至於基因突變引起的疾病,如果能透過基因編輯修正,必然是釜底抽薪、真正的治本。2012年之後因CRISPR技術成功在人類細胞內完成任務,目前更有許多按部就班、符合科學與倫理規範的基因編輯療法,正在進行人體試驗。從基因體解碼以來,人們期待的醫療革命,相信幾年內就會先在罕病、藥石罔效的末期病患身上實現。
本版增修時,正逢SARS冠狀病毒-2肆虐,已經變成全球性的瘟疫。因此特別探討這株病毒快速診斷的可能性(第10章),以及病毒生活史、治療的方向(第11章)。
此外,許多預測疾病風險的基因測試產品,不僅對消費者沒有助益,還會誤導人。面對誘人的商品,我們應當怎麼選擇才不會浪費了不必要的錢?希望讀者在享受科學新知、重新認識DNA 之際,也獲得實用的 DNA 消費指南。
高度敏感的定量工具—即時聚合酶連鎖反應
即時聚合酶連鎖反應技術最早是1992年由日裔的樋口提出的。他的初衷是想在不中斷連鎖反應、不打開試管的情況下即時看到連鎖反應的過程。由於溴化乙錠可以嵌入DNA雙螺旋之間受激釋出螢光,因此,在連鎖反應試管內加入溴化乙錠,若隨著反應進行,螢光也越來越強的話,表示有聚合作用,正在合成越來越多的雙螺旋。於是利用原有的機器配備一個激發和檢測螢光的裝置,第一台即時聚合酶連鎖反應儀器就此誕生。
由於模版初始濃度會影響聚合酶連鎖反應過程DNA產物的量,這個量又可以反映在螢光強度上,因此即時聚合酶連鎖反應有定量的特性。定量技術自產生以來,不斷發展完善,目前已經非常成熟了。標記物也由最初的單一染料發展到特異性更高的TaqMan探子。
偵測螢光比起利用電泳測定最終產物敏感許多,所以即時聚合酶連鎖反應也就比傳統聚合酶連鎖反應敏感。即時的意思就是每複製一次就偵測螢光一次,越早偵測到螢光表示初始標的序列濃度越高;就算檢體標的序列(也就是模版)濃度很低,也可以在複製35甚至40次之後偵測到螢光反應。所以即時聚合酶連鎖反應是敏感範圍極大定量檢查,可以清晰辨認的濃度範圍涵蓋107以上。
如果檢查的對象是RNA,因為RNA很脆弱、不耐操作,須先利用反轉錄酶把RNA反轉錄為穩定的互補DNA,再開始連鎖反應。這樣的實驗步驟稱為「即時反轉錄酶聚合酶連鎖反應」。
即時PCR的判讀方法,在於找到突破閥值的反應次數。如果檢體含有我們要偵測的標的序列,在反應到達一定的次數時會測到螢光強度以倍數上升,這個上升的趨勢可以維持之後幾次的反應,然後就到達高原區。利用這個突破閥值的反應次數,與標準濃度對照組突破閥值的反應次數做比較,就可以知道原始檢體濃度,所以即時聚合酶連鎖反應是一種定量檢驗。傳統聚合酶連鎖反應用反應最終產物做比較,就算檢體的初始濃度差很多,最後產物的濃度會集中在高原區,無法反映原始濃度,所以傳統聚合.連鎖反應是一種定性檢驗法。
即時聚合酶連鎖反應還有一個好處是比傳統反應敏感。傳統反應有一個跑膠的步驟,如果產物太少,有時候看不出來。即時反應偵測的是螢光,所以非常敏感。
即時反應的定量特性很重要,譬如愛滋病或B型肝炎的抗病毒療法,治療一段時間之後檢查血中病毒濃度,與治療前的濃度做比較,就可以知道治療策略是否有效,需不需要更改處方。利用即時聚合酶連鎖反應定量疫苗的濃度,可以確保疫苗品質。利用定量的特性計算羊水細胞第21號染色體與其他染色體核酸序列的比值,可以提高唐氏症篩檢的敏感度,這些用途都不是傳統聚合酶連鎖反應辦得到的。
2003年SARS冠狀病毒引發的肺炎
2003年春天,是我們這一代的人永遠難忘的日子。在那久無戰亂、科學昌明、生活富足的時空背景下,卻出現了一種特別喜歡攻擊醫護人員的鬼魅般新興疫病—SARS(嚴重急性呼吸道症候群)。至今,許多白衣天使在封鎖的醫院窗台上揮舞著布條吶喊求生的情景,仍鮮活地留存在許多人的記憶裡。
由中國廣東傳出的SARS,短短3個多月造成全球30幾國8千人遭受感染發病、近800人死亡,讓包括台灣在內許多國家的醫療系統面臨嚴重挑戰。其中最大的挑戰,在於如何早期診斷?唯有早期診斷,才能有效隔離具有傳染力的患者,才能斷絕傳播。
病因是一種新型的冠狀病毒,遺傳物質是單股正義RNA(正義的意思是指本身就是信使RNA),長約兩萬九千七百個核苷酸。加拿大率先於2003年4月13日公布病毒序列,4月16日世界衛生組織宣布新病毒正式命名為SARS冠狀病毒。
SARS冠狀病毒的可怕在於它突破了哺乳類宿主的藩籬,在基因改變之後順利進入人類呼吸道細胞繁衍。證據顯示,中國南方許多動物身上有它的蹤跡,如人工大量飼養的狸、貓、雪貂等。後來病毒外套的棘醣蛋白基因序列改變,讓這些棲身動物身上的病毒演變出跨越物種進入人體的能力。進入人體的病毒株在短時間內快速演化,變成可以致人於死,又可以從一個人直接傳給另外一個人的超級病毒。幸好它的傳播能力與流感病毒不同,從後來的研究可以看出來,有機會與病人接觸的人,被SARS病毒感染的比例極低。跟流感一傳十,十傳百的情形很不一樣。
2019年SARS冠狀病毒-2引發的肺炎
2019年12月,從中國湖北省武漢市華南市場爆發了一場殃及全球的肺炎,病原是SARS冠狀病毒-2(SARS CoV-2)。這次的流行型態跟之前2003年的SARS不大一樣。雖然它們都是以蝙蝠為天然宿主,但2019年的肺炎傳染力比較高,致死率比較低。同為冠狀病毒引起的2012年中東肺炎,天然宿主是駱駝,死亡率約四成。2003年SARS肺炎死亡率約一成,2019年 SARS冠狀病毒-2致死率約3.8%。
SARS冠狀病毒-2的表面有一種由醣蛋白組成的棘,棘醣蛋白是SARS病毒進入細胞的基本配備。這個蛋白有兩個功能區,一個負責讓病毒附著到細胞膜上的受體(ACE2),另一個讓病毒外膜和細胞膜融合,病毒才能進去細胞裡面。病毒附著細胞膜後,被細胞膜包覆吞入細胞成為胞內體,胞內體的蛋白酶切掉一部分的棘,融合功能區才能接觸到細胞膜。病毒的膜和胞內體的膜融合,病毒基因體就釋出到細胞質裡。
棘的中央附近有一個弗林(furin)切割位置。弗林是一種蛋白酶,細胞剛合成初級蛋白質要經過蛋白酶切割才會變得有活性。弗林的切割位置有獨特性,它辨識依特定順序排列的七個胺基酸,只有這種特定胺基酸序列才可以切斷。蝙蝠冠狀病毒無法跨種進入人類細胞,可能是因為它的棘沒有弗林切割位置,只能用蝙蝠獨有的蛋白酶做切割。病毒經過突變,讓棘有了弗林切割位置,是冠狀病毒成功從哺乳類跳躍到人類的可能原因之一。
棘醣蛋白也是誘發宿主產生中和抗體和細胞免疫的主要成分,是研發疫苗的重要目標。有些人被SARS冠狀病毒-2感染發病後痊癒了,他們血清中的中和抗體就可以用來治療同種病毒造成的肺炎重症。
細胞膜上的ACE2原本的作用是轉換血管收縮素。細胞因子血管收縮素可以讓血管收縮血壓升高,作用完後由ACE2轉換成血管擴張分子。恰好SARS冠狀病毒和SARS冠狀病毒-2的棘醣蛋白也可以附著在這個受體上,是這兩種病毒用來進入細胞的門戶。SARS冠狀病毒-2的附著能力是SARS冠狀病毒的10~100倍,這解釋了為什麼SARS2傳染力遠高於SARS。
呼吸道和消化道表皮細胞有較多的ACE2,因此這個病毒比較有機會從呼吸道或消化道細胞入侵人體。
病毒基因體是單鏈正義RNA,正義的意思是這股RNA跟信使RNA一樣可以直接轉譯蛋白,相對的反義就要經過一次轉錄,製造正義才能據以合成蛋白。基因體從病毒釋出到細胞質後,一開始先利用細胞的工具生產複製機器。複製機器的零件包含兩種蛋白酶,一種以RNA為模版合成新RNA的聚合酶(RdRp),和一種解螺旋.。解螺旋.很重要,雖然冠狀病毒基因體是單股RNA,但至少轉錄新RNA後模版跟新股的分離就需要解螺旋酶。
聚合酶轉錄病毒RNA,產出全長或依據基因轉錄的長長短短反義RNA。之後這些反義再轉出正義的病毒基因體或信使,細胞依據信使製造病毒的各種零件,這些結構蛋白零件和基因體打包成新的病毒,經過表面蛋白醣化處理後離開細胞。
棘醣蛋白、兩種蛋白酶、RNA聚合酶和解螺旋酶這五個病毒零件是抗病毒藥物的標的,其中已經有好消息的是針對聚合酶設計的藥物,可能是2019年以來這場瘟疫的解方。
以RNA為模版合成新RNA的聚合酶是病毒複製的關鍵工具,病毒基因進入細胞要趕緊讓細胞製造這個酶,才可以進行接下來的複製工程。聚合酶製作新RNA的時候需要用到腺苷酸、鳥苷酸等四種核苷酸,美國吉利德科學公司的專利化合物瑞德西韋(Remdesivir)是腺苷酸類似物,聚合酶誤取類似物當建材的話,複製就沒辦法延續了。美國第一例SARS冠狀病毒-2肺炎在患者病情變嚴重的時候,緊急投予瑞德西韋,次日病情明顯好轉。瑞德西韋還沒獲准上市,目前正在做臨床試驗。已上市的流感抗病毒藥物Favipiravir是一種鳥苷酸類似物,實驗室證據指出這藥可能可以阻礙SARS冠狀病毒-2的複製,也是經由干擾病毒聚合酶的途徑,但是到達有效濃度時也已經對細胞產生毒性。目前也正在進行人體試驗以確認效果。
還有一種以往用來治療瘧疾的氯奎寧也可能有效。近年來氯奎寧漸漸擠身抗病毒藥物之林,作用機制是氯奎寧會提高胞內體的酸鹼度,這一來可能讓蛋白酶無法切割修飾棘醣蛋白,病毒的膜和胞內體的膜無法融合,病毒生活週期就被中斷了。氯奎寧還有調節免疫的功能,病毒感染有時引發病患的細胞激素風暴致死,投與氯奎寧可能降低了風暴的風險。類似藥羥氯奎寧後來居上,法國的研究給20名感染SARS冠狀病毒-2的患者投這藥,6天後其中14名已測不到病毒。沒有投藥的16名對照組則只有2名測不到。比起氯奎寧,羥氯奎寧可能效果更好,副作用更少。台灣的信東、強生、應元、健亞等7家生醫藥業者擁有藥證可生產此藥。
SARS冠狀病毒的實驗診斷可分為以抗原或抗體為檢驗對象的血清學檢驗法,或以核酸分子為對象的「即時聚合酶連鎖反應」。相較於抗體必須在發燒起第10天以後才測得到,即時聚合酶連鎖反應可以在病程早期,如發燒第二、三天就偵測到病毒。所以即時聚合酶連鎖反應對公共衛生的幫助很大又很實際,是重要的工具。但是缺點在於必須用病患的呼吸道分泌物做為檢體,血液沒辦法檢出病毒,雖然可以驗出抗體,畢竟有時緩不濟急。面對SARS這種具傳染力的新興疾病,採集痰液常常會造成醫護人員的危險與恐懼。