生物晶片與基因工程

分子生物技術的樞紐

魏耀揮

任教於陽明大學生化研究所

歷經十五年的設計改良與廣泛應用，PCR已經站穩其位居分子生物學及生物醫學發展的樞紐地位，同時也為生物技術產業帶來了無限的商機。

在科學研究的過程中，偶而會有一種觀念或研究方法的創新，進而帶動了某一些領域的革命性發展與長足的進步。聚合 連鎖反應（polymerase chain reaction，簡稱PCR）就是這樣的一種分子生物學技術。這個技術的發展因為成功地結合了生物化學、分子生物學、生物技術及自動化操作，因而立下了一個科技發展的典範。它對廿世紀末生命科學和基礎醫學的研究發展，帶來了全面性的影響，並且已逐漸地衝擊著我們的日常生活。因此，有不少學者曾稱PCR為近十餘年來促進分子生物學及相關領域發展的最重要研究技術。

何謂PCR？

簡單地說，聚合 連鎖反應是運用一種具高耐熱性質的DNA聚合 （thermostable DNA polymerase）在一對高特異性的引子（primers）引導下，在短時間內大幅增量某一特定之DNA序列（target sequence）的分子生物學技術。雖然DNA聚合 這種酵素及其催化反應，早在七0年代初期就已是生物化學研究的焦點，但是一直到八0年代初期才真正有應用DNA聚合 進行PCR的構思。第一篇真正的PCR論文是由當時任職於Cetus牛物科技公司的Kary B. Mullis（圖一）和他的六個合作研究者於八五年發表於美國的《科學》（Science）上。這項技術的基本原理是：先以高溫處理擬增量的DNA樣本（denaturation，變性階段），使互補的兩股DNA分開：再以一對含20－30個核 酸的引子結合於分開的兩股DNA特定的部位上（annealing，黏合階段）；最後，由高耐熱性的DNA聚合 拷貝該對引子面對面所涵蓋的那一段DNA序列（extension，擴展階段），這樣就完成了一個PCR循環；如此進行下去即可在很短的時間內以指數級數的方式大幅增量該特定的DNA序列（圖二）。理論上，在進行n個PCR循環之後，即可將DNA增量為2n倍；因此，經過三十個PCR循環，就可以使一個DNA分子增加為230(1.071×109)個。

由於這個技術能以高選擇性的方式快速量產（scale up）所要的基因片段或具特定功能的DNA序列，它的發展與應用潛力很快就受到許多不同科學領域的研究者注意。PCR不但很快地成為分子生物學研究的常規工具，同時也立即被用來檢測各種與人類疾病有關的基因突變、病毒或細菌感染、食物與環境（水或土壤）中致病微生物及寄生蟲的污染，甚至在一些特殊的刑事或民事案件上被運用於罪犯鑑定或親子鑑定。而且，PCR技術也迅速地進人演化生物學、考古學、動物與植物育種等範疇，並改變了許多生命科學研究者的研究觀念與實驗方法。

基於PCR技術問世不到五年的時間，即對廣泛的科技領域造成普遍性的影響，美國的《科學》乃將PCR選為八九年的「年度風雲分子」（The Molecule of the Year），加州柏克萊大學生化系資深教授（也是當時《科學》的主編）Daniel E. Koshland特別為PCR獲選的理由寫了一篇社論。他認為當年同時有許多重要的科學研究與發展上的突破，但是PCR卻遙遙領先所有的其他競爭者，因為評審們認為「PCR自從誕生以來幾年間已經發展成為現代生物學最強而有力的研究工具之一」（PCR has developed into one of the most powerful tools of modern biology since its discovery several years ago）。而Mullis更因為研發PCR技術的卓越貢獻榮獲瑞典皇家學院頒授九三年的諾貝爾化學獎。

PCR的發展史

八0年代初期，Mullis提出PCR的概念後，美國北加州的Cetus生物技術公司人類遺傳學部門的一個研究小組立即運用於增量人類的β-globin基因的DNA序列上，以此診斷鐮刀型貧血症。Mullis初期的實驗是運用大腸桿菌DNA聚合 的Klenow fragment催化聚合 鏈鎖反應，由於該酵素的熱不安定性質，在進行PCR的過程中需要不斷添加DNA聚合 ，不但十分不方便，實驗的品質管制也相當困難。此外，用人工的方式將反應試管在三個定溫水槽中反覆移動，以便在三個溫度下進行PCR的循環操作實在是一種龐大的人力負擔。針對以上的缺點，於是有了PCR自動化操作的研發。在過去的十多年來PCR技術已經歷了許多階段的改良。其中最重要的是以高耐熱性的Taq DNA聚合 取代大腸桿菌DNA聚合 I的Klenow fragment，使整個PCR反應過程都在一個密閉的試管中進行，不但省去不斷添加 DNA聚合 的麻煩，提高 PCR增量DNA的效率和產量，同時也簡化了PCR自動化操作。

Taq DNA聚合 是一種高耐熱性的酵素，一九六九年發現於美國黃石國家公園溫泉的嗜熱細菌Thermus aquaticus之中。七0年代中期，陽明大學神經科學研究所的錢嘉韻教授於美國愛荷華州立大學攻讀博士學位時，首度從Thermus aquaticus純化出來這種高耐熱性的DNA聚合 。

因為原始的Taq DNA聚合 不具有校讀（proofreading）新合成DNA序列所需要的3'→5'外核 酸 ，使用Perkin－Elmer／Cetus公司早期生產的Taq DNA聚合 所得之PCR產物通常會有較高的DNA複製錯誤率（replication error rate）。據估計鹼基置換突變率（base substitution rate）為 1／9000，而移位突變率（frameshift error rate）則為1／41000左右。

過去這許多年來，在世界各國的生物技術公司研究發展部門的努力下，科學家以遺傳工程及定點突變的技術改良這個酵素，目前已經有好幾種改良型的DNA聚合 問世，有的具有3'→5'外核 酸 可以提高 DNA複製的忠實度（fidelity）（如 Pfu DNA Polymerase），有些產品（如 TaKaRa Ex TaqTM DNA polymerase）更可以用來進行超長距聚合 連鎖反應（extra-long PCR, XL-PCR）而大幅增加 PCR產物的DNA長度；甚至有專門為進行反轉錄聚合 鏈鎖反應（RT－PCR）而設計的重組型Taq DNA聚合 ，同時具有（RNA－dependent DNA polymerase）及（DNA-dependent DNA polymerase）的兩種酵素活性（如rTth DNA polymerase）。

除了DNA聚合 的不斷改良與自PCR衍生出來的各種生物技術的發展，PCR也帶動了操作裝置“DNA thermal cycler”的研發，從早期Perkin-Elmer 公司設計之48個反應槽的Thermal cycler 480型（圖三），9600型與最近的96個反應槽的Gene Amp PCR System 9700型及24個反應槽的PCR System 2400型機器，到目前具有特殊功能的In Situ PCR System1000及能配合大量DNA定序操作之High－throughput PCR系統的開發，都是拜PCR之賜而興起的另一種生物科技產業。

PCR的應用

因為PCR技術具有迅速增量DNA的功能，它最原始的應用是人類致病基因的分析與DNA突變的偵測。通常只需要很少的檢體（血液、毛髮或組織檢體）就可以進行DNA的萃取和PCR增量，再配合限制 切割的分析（限制 片段長度多形性，簡稱PCR－RFLP）或PCR產物的DNA定序分析，即可迅速地找到發生DNA突變的核 酸部位或進行基因型的鑑定（genotyping）。這樣的遺傳資料所彙集而成的基因庫，不但可作為臨床醫師診斷遺傳疾病的參考，也可以用來建立各種生物的演化途徑及親緣關係。另一方面，由於PCR具有選擇性增量DNA的功能，它也廣泛地被應用於偵測存在血液、體液、飲水、食物及環境污染物中的極少量之細菌或病毒。PCR也可以用來偵測與某一些疾病的初期病變過程有關之基因產物（如 RT－PCR技術），最近甚至用於檢查癌細胞的出現及轉移，以作為預防和治療癌症的參考。在分子生物學的研究上，PCR更是簡化許多遺傳工程實驗操作的有力工具；在基因選殖、定點突變及DNA定序等例行實驗上，皆因各種PCR技術而簡化了許多操作程序，同時也大幅提高了工作的效率與實驗的品質。我們可以說PCR技術的發展與應用的成長速度，就像Taq DNA聚合 複製DNA的速度一樣快。

PCR發展的啟示

從PCR這個概念的孕育到實驗設計，我們可以發現：Mullis運用當時既有的基礎研究成果，特別是有關DNA聚合 的基本生化性質及其催化DNA複製的反應機轉，並能融合引子延伸（primer extension）的概念，設計一對高特異性的引子來界定所欲增量的DNA序列，很有創意地在三個不同的溫度下循環DNA複製的反應，以達到大幅增量DNA的目的。因此，PCR的開創與發展並不像大部分的生命科學研究突破－奠基於埋首實驗室工作多年所累積的實驗成果，而是一種整合前人已經建立的研究成果所形成的創新設計（innovative design）。 Mullis是一位重視思考的科學家，他大學時代在喬治亞工學院主修化學，到加州柏克萊大學攻讀博士學位時卻轉而探究宇宙的擴增（universe expanding）與縮小（shrinking）的現象。廣泛而紮實的科學思考訓練，對他日後開創PCR理論與實驗設計有相當大的助益。據他自己說，PCR的靈感是一次從舊金山開車往孟得西諾（Mendocino）途中得到的。Mullis這一種因著創造性思考而成功的典範，在這個資訊發展如此迅速的時代裡，更值得我們深思。

結語

歷經十五年的設計改良與廣泛應用，PCR已經成為增量和分析DNA與RNA最重要的分子生物學技術。隨著循環控溫器（thermal cycler）的自動化和各種新的核酸標示系統（DNA labeling system）與偵測方法（detection method）的發展，PCR操作更加地簡便和微量化，其應用也更加地普遍了。為了因應各種研究的需要，數種可作定量分析用的PCR技術（quantitative PCR technology）及所謂的Real-time PCR系統（譬如： Perkin-Elmer Taqman and 7700 fluorescence plate reader system）也已經應運而生了。特別值得注意的是，過去三年來DNA微矩陣列（microarrays）和生物晶片（如：DNA chips）的研究發展，以及各種自PCR衍生而來的生物技術（PCR-based technology）更使PCR站穩其位居分子生物學及生物醫學發展的樞紐地位，同時也為生物技術產業帶來了無限的商機。

分子生物技術的樞紐

魏耀揮

任教於陽明大學生化研究所

歷經十五年的設計改良與廣泛應用，PCR已經站穩其位居分子生物學及生物醫學發展的樞紐地位，同時也為生物技術產業帶來了無限的商機。

在科學研究的過程中，偶而會有一種觀念或研究方法的創新，進而帶動了某一些領域的革命性發展與長足的進步。聚合 連鎖反應（polymerase chain reaction，簡稱PCR）就是這樣的一種分子生物學技術。這個技術的發展因為成功地結合了生物化學、分子生物學、生物技術及自動化操作，因而立下了一個科技發展的典範。它對廿世紀末生命科學和基礎醫學的...

主編序
分子生物技術的樞紐　　魏耀揮
DNA微陣列　　許志
透視生命的基因微陣列　　楊士德
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微生物辨識DNA晶片　　劉文佐
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基因工程的衝擊　　趙清貴、林淑端
基因工程的倫理思考　　許漢
基因科技與風險全球化趨勢　　周桂田
基因解碼後的社會震撼　　李建會
漫談單核酸多型性　　張猷忠
PCR的故事　　潘震澤
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