空氣中奈米微粒直接進行細胞株危害技術探討(I) 101白H323

　　奈米微粒對生物體產生的毒性與危害，至今仍未十分瞭解，奈米微粒有許多獨特的物化特性，而這些特性可能會影響其危害狀況。雖然毒性測試的方法種類甚多，但是目前尚缺少合理且共通的生物毒性指標、毒性測試系統與危害評估平台等技術來評估奈米微粒之風險，作為奈米微粒分級管理機制的參考，特別是暴露於空氣中奈米微粒。計畫就是探討將體外細胞株危害測試應用於奈米微粒風險分級管理參考依據的挑戰與方法，瞭解空氣中奈米微粒的危害特性及影響測試的因素，並將這些資訊應用在分級管理上。

　　奈米微粒毒性之測試方法可分為動物試驗(Animal experiments)、活體細胞試驗(ex vivo)和體外細胞株試驗（in vitro）等。in vitro無法像活體一樣接近生物體中原始暴露奈米微粒的狀況，也不能模擬暴露時所有細胞間的相互作用，無法完全取代動物試驗，但體外細胞株試驗可避免動物實驗的道德爭議、實驗成本較低與可針對特定細胞做直接的測試等優勢，故使用浸沉培養方法的體外細胞株試驗被廣泛的使用。

　　為降低可能影響因素，對於呼吸暴露微粒之in vitro毒性測試，近來越來越多研究者建議使用空氣-液界面 （air-liquid interface, ALI） 細胞暴露系統。因為ALI暴露實驗於氣液界面發生暴露行為的設計與真實情況較為相似，應可使實驗結果更具代表性，且細胞暴露的劑量亦較易準確的定量與控制。 計畫評估過去所建立之靜電收集(ESP)式ALI的細胞株暴露氣懸微粒系統，釐清微粒真正沉積於細胞株培養基之影響因素，綜合實驗與電腦流場模擬分析結果，設計改良暴露系統，增加奈米微粒之區域沉積比率及氣液收集介面之均勻分佈。計畫也探討不同狀況下微粒之細胞株危害，測試微粒於測試過程中之物化特性，包括不同粒徑之奈米銀及奈米二氧化鈦，在水溶液、細胞培養液、含有1 %血清之細胞培養液與含有1 % 甘氨酸(Glycine)混合1% 血清之細胞培養液狀態下之物化特性，選擇試驗細胞株為人類正常肺臟細胞株BEAS-2B(或A549)及小鼠巨噬細胞株RAW264.7，而以特定的染劑(MTS)在粒腺體中被轉換形成不同顏色的結晶產物判斷試驗物質的細胞毒性及細胞存亡分析法(Live∕Dead cell viability assay)二種方式來評估細胞株危害情形，並以不同螢光染劑分析多種生物效應指標，同時運用即時定量聚合酶鏈鎖反應（Real-time PCR）與西方墨點法（Western blot）分析基因與蛋白表現量之變化。 研究已改良ESP式ALI暴露系統，可增加奈米微粒之區域沉積比率，並建立估算式，估算ALI暴露系統的各參數對於微粒暴露劑量（Dose）的影響，實際使用奈米微粒進行測試，適當的暴露環境和操作參數下，可有效增加暴露量及均勻性。

　　研究自行合成不同粒徑之銀與二氧化鈦微粒，確認物化特性，並透過鱟阿米巴樣細胞裂解物（LAL）凝膠法確認不受內毒素汙染，微粒浸泡溶液藉由測試不同浸泡液及震盪時間之水合粒徑來設定最佳細胞株暴露之條件進行毒性試驗。測試結果顯示，小粒徑奈米銀在各項測試方法中皆有一致之毒性效應關係，且不會對於螢光測試方法有干擾之作用，但小粒徑奈米二氧化鈦則出現螢光干擾作用，需進一步尋求螢光染色試劑之外的測試方法。小粒徑奈米銀暴露細胞後會誘導活性氧物種（ROS）生成、血基質氧化酶（HO-1）基因表現、細胞自體吞噬與細胞凋亡的產生，因而對於早期奈米毒性之評估，計畫建議可利用偵測HO-1之基因與蛋白質表現，及分析細胞自吞噬現象作為初步判定指標。對於奈米微粒之危害評估平台，計畫提出一個細胞株毒性篩選流程架構，首先針對受試之奈米物質進行物化特性分析，利用動態光散射（DLS）與穿透式電子顯微鏡（TEM）確認其尺寸大小與特性，分析其是否為可見光或螢光干擾的物質，選定試劑進行細胞存活率、HO-1與細胞自體吞噬分析，以判斷奈米受試物之危害效應。